序列出現混合訊號

狀況描述

  • 序列一開始會有兩個以上的波峰出現。
  • 平均訊息值正常。

發生的可能原因

  • 在定序反應時,有其他template DNA的污染。
  • Primer污染。兩個以上可以與template DNA作用的primer一起做定序反應。
  • PCR產物未純化乾淨,殘存forward與reverse primers。
  • Template DNA 上有兩個以上的位置可以被同一個定序用的primer黏合。常見於擁有universal priming site的PCR產物接合到載體上。
  • 定序反應時primer annealing溫度調太低。
  • 在純化定序後的產物時汙染到其他樣品的產物。

解決方式

  • 確定template DNA 只有一個。可先跑洋菜膠電泳粗略確定是否有其他DNA污染,但是即使在膠上只看到單一產物,也無法代表沒有其他微量的非預期產物出現,或沒有其他相似大小的非預期產物在其中。
  • 確認template DNA上是否可以被同一個定序用的primer 黏合。
  • 確認在純化PCR產物時是否將殘存的 primers 及 dNTP 去除乾淨。
  • 確認定序primer的Tm值。若primer的Tm值高於定序所設定的annealing溫度5℃以上時,則調高定序時的annealing溫度。

 

 
 

狀況描述

  • 同一處會有兩個以上的波峰出現。
  • 重疊序列一般出現在50bp 之後cloning site 的起始位置,較低的序列與預期的序列不同,所謂two clones。
     

發生的可能原因

  • 在定序反應時,有其他template DNA的污染。
  • 挑取single colony時同時挑到兩個colonies。常發生在兩個single colony靠太近時不小心污染到。
  • 確定template DNA 只有一個。可先跑洋菜膠電泳粗略確定是否有其他DNA污染,但是即使在膠上只看到單一產物,也無法代表沒有其他微量的非預期產物出現,或沒有其他相似大小的非預期產物在其中。
  • 避免挑取single colony時同時挑到兩個colonies。如發生此狀況建議重新挑選新的colony。
     

 
 

狀況描述

序列前端混亂且有明顯的終止點,後端則波峰清楚可判讀。

發生的可能原因

一般發生於PCR 產物定序時,出現非預期的產物,干擾主要產物的定序結果。

解決方式

重新進行純化,去除非預期產物。如果主要產物與非預期產物片段大小不同,可利用洋菜膠體進行分離後純化出單一產物。