序列出現混合訊號
狀況描述
- 序列一開始會有兩個以上的波峰出現。
- 平均訊息值正常。
發生的可能原因
- 在定序反應時，有其他template DNA的污染。
- Primer污染。兩個以上可以與template DNA作用的primer一起做定序反應。
- PCR產物未純化乾淨，殘存forward與reverse primers。
- Template DNA 上有兩個以上的位置可以被同一個定序用的primer黏合。常見於擁有universal priming site的PCR產物接合到載體上。
- 定序反應時primer annealing溫度調太低。
- 在純化定序後的產物時汙染到其他樣品的產物。
解決方式
- 確定template DNA 只有一個。可先跑洋菜膠電泳粗略確定是否有其他DNA污染，但是即使在膠上只看到單一產物，也無法代表沒有其他微量的非預期產物出現，或沒有其他相似大小的非預期產物在其中。
- 確認template DNA上是否可以被同一個定序用的primer 黏合。
- 確認在純化PCR產物時是否將殘存的 primers 及 dNTP 去除乾淨。
- 確認定序primer的Tm值。若primer的Tm值高於定序所設定的annealing溫度5℃以上時，則調高定序時的annealing溫度。
狀況描述
- 同一處會有兩個以上的波峰出現。
- 重疊序列一般出現在50bp 之後cloning site 的起始位置，較低的序列與預期的序列不同，所謂two clones。
發生的可能原因
- 在定序反應時，有其他template DNA的污染。
- 挑取single colony時同時挑到兩個colonies。常發生在兩個single colony靠太近時不小心污染到。
- 確定template DNA 只有一個。可先跑洋菜膠電泳粗略確定是否有其他DNA污染，但是即使在膠上只看到單一產物，也無法代表沒有其他微量的非預期產物出現，或沒有其他相似大小的非預期產物在其中。
- 避免挑取single colony時同時挑到兩個colonies。如發生此狀況建議重新挑選新的colony。
狀況描述
序列前端混亂且有明顯的終止點，後端則波峰清楚可判讀。
發生的可能原因
一般發生於PCR 產物定序時，出現非預期的產物，干擾主要產物的定序結果。
解決方式
重新進行純化，去除非預期產物。如果主要產物與非預期產物片段大小不同，可利用洋菜膠體進行分離後純化出單一產物。