定序失敗

為使您更了解你收到的定序結果,我們提供以下多種常見範例供您參考。

核酸定序結果判定範例

 

狀況描述

  • 圖形呈現雜亂無章的波峰。
  • 除了在70 bp 與 110 bp 左右有強烈的染料訊號外,其餘皆為低訊號值。
  • 平均訊號強度低於100。
  • 其訊號無法與預期的序列相符合,或者無法比對到 GeneBank 中的任何序列。
     

發生的可能原因

  • DNA 品質不佳。

  • 在酒精沉澱純化步驟時,發生 DNA lose。

  • 太少的 template DNA

  • 使用錯誤的引子。

  • 定序反應用的水受到污染。受污染的水中含有抑制反應的物質。

  • 合成引子失敗或引子降解。使用的引子在合成時失敗,所以無法用於定序。

  • 定序試劑失去活性。BigDye 試劑若儲存太久,或者儲存在非適當環境下會造成 Taq 活性喪失與螢光標定 nucleotides 的螢光衰退。

  • 毛細管阻塞。
     

解決方式

  • DNA 品質不佳。使用純化試劑組進行二次純化,去除 DNA 中的雜質。

  • 在酒精沉澱純化步驟時,發生 DNA lose。可改用純化試劑組來替代酒精沉澱法,通常會有不錯的效果。

  • 太少的 template DNA。在做定序反應前,將 template DNA 跑一次 agarose gel 用以確定 DNA 濃度,並且也可以順便確定樣品是否有genomic DNA與RNA的污染。

  • 使用錯誤的引子。重新確認 primer 的序列及其正確性。

  • 定序反應用的水受到污染。請使用乾淨無污染的水。

  • 引子降解。重新合成引子,將其回溶保存於適當環境下。

  • 定序試劑失去活性。公司內部試劑皆經嚴格管理,所以這種狀況較少發生。